Desarrollo de método HPLC 2D off-line para análisis cualitativo de proteínas mediante Q-TOF-MS

Abstract

El presente trabajo describe el desarrollo de un proyecto de proteómica que trata de desarrollar un método de análisis de proteínas mediante cromatografía líquida en dos dimensiones (2DHPLC) off-line. Como instrumento cromatográfico en la primera dimensión se utilizó un ÄKTA Pure 25 con un detector DAD acoplado a un colector de fracciones automático. Por otro lado, el instrumento utilizado en la segunda dimensión fue un nano-HPLC acoplado a un espectrómetro de masas en tándem (MS/MS) Triple-TOF. El análisis en ambas dimensiones se llevó a cabo mediante fase reversa (RP), por ello, para aportar ortogonalidad a la separación 2D se utilizó la estrategia de “2D-RPLC pH alto-pH bajo”. Es decir, la separación y fraccionamiento de la muestra en la primera dimensión se llevó a cabo en medio básico y posteriormente, en la segunda dimensión las fracciones se analizaron a pH ácido. El método de masas utilizado para el análisis de proteínas fue “data-dependent acquisition” (DDA). El instrumento utilizado para el análisis y posterior fraccionamiento de la muestra había sido instalado recientemente. Por ello, el proyecto empezó por la puesta a punto del equipo. Para dicha puesta a punto se realizaron diversas pruebas de reproducibilidad y de la precolumna que iba a ser utilizada como tratamiento de limpieza de muestra on-line. Tras valorar los resultados obtenidos con la precolumna se decidió descartar el uso de la misma. Tras la puesta a punto del equipo, se optimizó el gradiente para obtener así una distribución homogénea de las proteínas a lo largo del cromatograma y conseguir así fracciones de complejidad parecida. Posteriormente se estudió el uso de la concatenación como estrategia para aumentar la cantidad de proteínas identificadas. Para ello, se fraccionaron dos muestras idénticas en diferentes cantidades de fracciones; una en 13 fracciones y otra en 44. Las 44 fracciones fueron concatenadas obteniendo así un total de 11 fracciones combinadas. Por último, las fracciones de ambas muestras, y una muestra sin fraccionar, fueron analizadas mediante nano-HPLC-MS/MS y los resultados obtenidos se compararon. En base a los resultados, por un lado, se llegó a la conclusión de que, la concatenación no es una estrategia a seguir en el método diseñado. Por otro lado, mediante la incorporación de una separación y fraccionamiento cromatográfico previo (de una segunda dimensión) al análisis por nano-HPLCMS/MS se triplicó el número de proteínas identificadas consiguiendo un total de 4041 .