Desarrollo de método HPLC 2D off-line para análisis cualitativo de proteínas mediante Q-TOF-MS
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Título
Desarrollo de método HPLC 2D off-line para análisis cualitativo de proteínas mediante Q-TOF-MSAutoría
Tutor/Supervisor; Universidad.Departamento
Sanchis Llopis, Juan Vicente; Universitat Jaume I. Departament de Química Física i Analítica; Fernández, JoaquínFecha de publicación
2018-09Editor
Universitat Jaume IResumen
El presente trabajo describe el desarrollo de un proyecto de proteómica que trata de desarrollar
un método de análisis de proteínas mediante cromatografía líquida en dos dimensiones (2DHPLC) off-line. Como instrumento ... [+]
El presente trabajo describe el desarrollo de un proyecto de proteómica que trata de desarrollar
un método de análisis de proteínas mediante cromatografía líquida en dos dimensiones (2DHPLC) off-line. Como instrumento cromatográfico en la primera dimensión se utilizó un ÄKTA
Pure 25 con un detector DAD acoplado a un colector de fracciones automático. Por otro lado, el
instrumento utilizado en la segunda dimensión fue un nano-HPLC acoplado a un espectrómetro
de masas en tándem (MS/MS) Triple-TOF. El análisis en ambas dimensiones se llevó a cabo
mediante fase reversa (RP), por ello, para aportar ortogonalidad a la separación 2D se utilizó la
estrategia de “2D-RPLC pH alto-pH bajo”. Es decir, la separación y fraccionamiento de la muestra
en la primera dimensión se llevó a cabo en medio básico y posteriormente, en la segunda
dimensión las fracciones se analizaron a pH ácido. El método de masas utilizado para el análisis
de proteínas fue “data-dependent acquisition” (DDA).
El instrumento utilizado para el análisis y posterior fraccionamiento de la muestra había sido
instalado recientemente. Por ello, el proyecto empezó por la puesta a punto del equipo. Para
dicha puesta a punto se realizaron diversas pruebas de reproducibilidad y de la precolumna que
iba a ser utilizada como tratamiento de limpieza de muestra on-line. Tras valorar los resultados
obtenidos con la precolumna se decidió descartar el uso de la misma.
Tras la puesta a punto del equipo, se optimizó el gradiente para obtener así una distribución
homogénea de las proteínas a lo largo del cromatograma y conseguir así fracciones de
complejidad parecida. Posteriormente se estudió el uso de la concatenación como estrategia
para aumentar la cantidad de proteínas identificadas. Para ello, se fraccionaron dos muestras
idénticas en diferentes cantidades de fracciones; una en 13 fracciones y otra en 44. Las 44
fracciones fueron concatenadas obteniendo así un total de 11 fracciones combinadas. Por
último, las fracciones de ambas muestras, y una muestra sin fraccionar, fueron analizadas
mediante nano-HPLC-MS/MS y los resultados obtenidos se compararon. En base a los
resultados, por un lado, se llegó a la conclusión de que, la concatenación no es una estrategia a
seguir en el método diseñado. Por otro lado, mediante la incorporación de una separación y
fraccionamiento cromatográfico previo (de una segunda dimensión) al análisis por nano-HPLCMS/MS se triplicó el número de proteínas identificadas consiguiendo un total de 4041 . [-]
Palabras clave / Materias
Descripción
Treball de Fi de Màster Universitari en Tècniques Cromatogràfiques Aplicades (Pla de 2013). Codi: SIY009. Curs 2017/2018
Tipo de documento
info:eu-repo/semantics/masterThesisDerechos de acceso
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